La bilirrubina directa (conjugada) reacciona con la sal de diazonio 2,4-diclorofenildiazonio (2,4-DPD) en presencia de ácido sulfámico formándose azobilirrubina, este complejo coloreado puede ser medido fotométricamente a 546 nm. De las dos fracciones de bilirrubina presentes en suero, glucuronato de bilirrubina (conjugada) y bilirrubina libre asociada a albúmina (no conjugada), sólo reacciona directamente la primera, mientras que la bilirrubina libre precisa ser disociada de la proteína por un acelerador para que reaccione. La bilirrubina indirecta se calcula por diferencia entre la bilirrubina total (con acelerador) y la directa (sin acelerador). Los conceptos «directa» e «indirecta» se refieren exclusivamente a las características de reacción en presencia o ausencia de aceleradores o solubilizantes y equivalen sólo de forma aproximada a las dos fracciones de bilirrubina citadas.
